Хроматография

Хроматография — бұл әртүрлі қоспаларды бөлудің зертханалық әдісі. Қоспа жылжымалы фаза деп аталатын сұйықтықта ерітіледі де, ол оны стационарлы фаза деп аталатын басқа материал бойымен өткізеді. Қоспаның әртүрлі құрамдас бөліктері станционарлы фаза бойында әртүрлі жылдамдықпен қозғалады, бұл олардың бөлінуіне әкеледі. Бөліну компоненттердің жылжымалы және стационарлы фазалар арасында әртүрлі болып таралуына негізделген. Құрамдас заттардың таралу коэффициенттері әртүрлі болғандықтан, олар станционарлы фазада әртүрлі уақыт тежеледі, бұл заттардың бөлінуіне алып келеді.

Өсімдік экстрактының компоненттерін ажыратуға қолданылған жұқа қабатты хроматография. Бұл эксперимент хроматорграфияның атауын берді.

Хроматографияның негізгі екі түрі: препаративті және аналитикалық. Препаративті хроматографияның мақсаты - қоспаның компоненттерін кейінірек пайдалану үшін бөлу, сондықтан заттарды тазартудың жолы болып табылады. Аналитикалық хроматография әдетте аз мөлшердегі материалмен орындалады және қоспадағы аналиттердің мөлшерін немесе бар болуын анықтауға арналған. Препаративті хроматография аналитикалық бола алмайды, және керісінше.

Этимологиясы

Хроматография сөзі грек тіліндегі χρῶμα, яғни "түс", және γράφειν («жазу») деген сөздерден шыққан

Тарихы

Хроматографияны алғаш рет Ресейде 1900 жылы итальян текті ғалым Михаил Цвет қолданған. Ол ХХ ғасырдың басында, ең алдымен, хлорофилл, каротин және ксантофилл сияқты өсімдік пигменттерін бөлу үшін хроматографиямен жұмыс істеді. Бұл компоненттер әртүрлі түстерге ие болғандықтан (сәйкесінше жасыл, қызғылт сары және сары), олар бұл әдіске өз атауын берді. 1930-1940 жылдары дамыған хроматографияның жаңа түрлері көптеген бөлу процестері үшін қолдыныла бастады.

Хроматография әдісі Арчер Жон Портер Мартин мен Ричард Лоренс Миллингтон Сингтің 1940-1950 жылдардағы жұмысының нәтижесінде айтарлықтай дамыды, ол үшін олар 1952 жылы химия бойынша Нобель сыйлығын алды. Олар таралу хроматографиясының принциптері мен негізгі әдістерін анықтады және олардың жұмысы бірнеше хроматографиялық әдістердің тез дамуына ықпал етті, атап айтқанда, қағаз хроматографиясы, газ хроматографиясы және өнімділігі жоғары сұйық хроматография. Содан бері технология тез дамып келеді. Зерттеушілер М. Цвет хроматографиясының негізгі принциптерін қолданып, нәтижесінде төменде сипатталған хроматографияның алуан түрлерін дамытуға болатындығын анықтады. Даму хроматографияның техникалық көрсеткіштерін үнемі жақсартып отырады, қазіргі кезде бұл тіпті өте ұқсас молекулалардың өзін бөлінуіне мүмкіндік береді. Сондай-ақ, хроматография каннабистің потенциалын тексеру әдісі ретінде де қолданылды.

Хроматографиядағы терминдер

• Аналит - бұл хроматография кезінде қоспадан бөлінетін зат. Бұл әдетте қоспадағы қажетті зат.
• Аналитикалық хроматография үлгідегі аналиттердің бар болуын немесе концентрациясын анықтау үшін қолданылатын хроматография түрі.
• Байланған фаза дегеніміз тіректің бөлшектерімен немесе баған түтігінің ішкі қабырғасымен ковалентті байланысқан стационарлы фаза.
• Хроматограмма - бұл хроматографтың шығаратын нәтижесі. Қоспа жақсы бөлінген жағдайда, хроматограммадағы әр шың бөлінген қоспаның әр компонентіне сәйкес келеді.

X осінде жүйедегі аналиттердің тежелу уақыты, ал Y осінде осы аналиттерге сәйкес келетін сигнал (мысалы спектрофотометр, масс спектрометр, т.б. детекторлардан алынған). Жүйе дұрыс жұмыс жасаса, сигнал аналиттің коспадағы концентрациясына пропорционал.

• Хроматограф немесе аэрограф - қоспаларды әртүрлі күрделі жолдармен бөлуге мүмкіндік беретін құрал, мысалы, газ хроматографы немесе сұйық хроматографы.
• Хроматография - бөлудің физикалық әдісі, ол компоненттерді бөлу үшін бірі қозғалмайтын (стационарлы фаза), екіншісі белгілі бір бағытта қозғалатын екі фаза арасында таратады.
• Элюат - бұл бағаннан шығатын жылжымалы фаза. Мұны эффлюент деп те атайды.
• Элюент - бұл аналиттерді тасымалдайтын еріткіш.
• Элюит - бұл аналит, элюцияланатын еріген зат.
• Элуотропты қатар дегеніміз - қуатына байланысты орналастырылған еріткіштердің тізімі
• Иммобилизацияланған фаза - тіректің бөлшектерінде немесе баған түтігінің ішкі қабырғасына қозғалмайтындай етіп орналастырылған стационарлы фаза.
• Жылжымалы фаза - бұл белгілі бір бағытта қозғалатын фаза. Ол сұйық (LC және капиллярлық электрохроматография (CEC)), газ (GC) немесе суперкритикалық сұйықтық (суперкритикалық сұйықтық хроматографиясы, SFC) фазасында болуы мүмкін. Жылжымалы фаза бөлінетін/талданатын үлгіден және оны баған бойымен жылжытатын еріткіштен тұрады. Өнімділігі жоғары сұйық хроматографиясын мысалға алсақ, қалыпты фазалы хроматографияда поларлы емес еріткіш (мысалы, гексан), ал кері фазалық хроматографияда поляр еріткіш (мысалы, метанол) мен бөлінетін үлгі жылжымалы фазаны құрайды. Жылжымалы фаза хроматографиялық баған арқылы қозғалады (стационарлы фаза), онда үлгі стационарлы фазамен өзара әрекеттеседі және бөлінеді.
• Препаративті хроматография талдау үшін емес, бөлінген заттарды одан әрі пайдалану үшін жеткілікті мөлшерде тазартуда қолданылады.
• Тежелу уақыты - белгілі бір аналиттің бағанның басынан детекторға дейін қозғалуына жұмсаған уақыты. Сондай-ақ: Ковац тежелу индексі
• Үлгі - хроматография арқылы талданған зат. Ол бір компоненттен тұруы да, компоненттердің қоспасы болуы да мүмкін. Талдау барысында тек бізді қызықтыратын аналит бар фазалар ғана үлгі болып табылады. Ал талдау алдында, немесе талдау барысында үлгіден бөлінген, бірақ бізді қызықтыратын аналиті жоқ бөліктер қалдық болып табылады.
• Еріген зат - хроматографиядағы қоспаның құрамдас бөліктері.
• Еріткіш - бұл басқа затты ерітетін кез-келген зат. Көбіне еріткіш деп сұйық хроматографиядағы жылжымалы фазаны айтады.
• Стационарлы фаза - бұл хроматография кезінде орнынан қозғалмайтын зат. Мысалы, жұқа қабатты хроматографиядағы кремний оксидінің қабаты.
• Детектор - бөлуден кейін аналиттерді сапалы және сандық анықтау үшін қолданылатын құрал.

Хроматографиядағы төсеніштің түрі бойынша әдістердің жіктелуі

Бағанды хроматография

Бағанды хроматография - стационарлы төсеніш түтік ішінде болатын бөлу әдісі. Қатты стационарлы фазаның бөлшектері немесе сұйық стационарлы фазамен қапталған тірек түтіктің бүкіл көлемін толтыруы мүмкін (толтырылған баған) немесе түтік қабырғасының бойында немесе түтіктің ортаңғы бөлігінде жылжымалы фаза үшін ашық жол қалдырып орналасуы мүмкін (ашық түтікті баған). Орта бойымен әртүрлі жылдамдықпен қозғалғандықтан, қоспаның компоненттерінің тежелу уақыты да әртүрлі.

1978 жылы У. Кларк Стил Бағанды хроматографияның жылдам бағанды хроматография деп аталатын өзгертілген нұсқасын ұсынды (флеш). Бұл әдіс дәстүрлі бағанды хроматографияға өте ұқсас, бірақ, еріткіш түтік арқылы қысым әсерінен қозғалады. Бұл көптеген бөлулерді 20 минуттан аз уақыт ішінде орындап қана қоймай, ескі әдіспен салыстырғанда жақсырақ бөлінуге алып келді. Қазіргі кезде флеш-хроматография жүйелері алдын-ала толтырылған пластик картридж түрінде сатылады, ал еріткіш картридж арқылы сығылып, қысыммен қозғалады. Сондай-ақ мұндай жүйелер аутоматтандыруды қамтамасыз ететін детекторлармен немесе фракция жинағыштармен байланысуы мүмкін. Градиентті сорғылардың енгізілуі бөлінуді одан әрі тездетіп, қолданылатын еріткіш мөлшерін азайтты.

Кеңейтілген төсенішпен жүретін адсорбция кезінде қатты фазалы толтырылған төсеніш емес, сұйылтылған төсеніш қолданылады. Бұл үлгіні дайындау кезінде кейбір тазарту қадамдарын жасамауға мүмкіндік береді. Мысалы, биоматериалдарды центрефугалау, не сүзу.

Фосфоцелюлозалы хроматография ДНҚ-мен байланысатын нәруыздардың фосфоцелюлозамен байланысу қабілетін қолданадаы. Нәруыздың ДНҚ-мен байланысы мықты болса, бұл нәруызды бағаннан элюциялап шығуға тұздың жоғары концентрациясы қажет.

Жазық хроматография

Жазық хроматография - стационарлы фаза жазық күйде болатын бөлу әдісі. Станционарлы фаза қағаз беті, қағазға сіңірілген зат (қағаз хроматографиясы) немесе шыны тәрізді тірекке жағылған қатты бөлшектердің қабаты (жұқа қабатты хроматография) болуы мүмкін. Үлгідегі әртүрлі қосылыстар стационарлы фазамен қаншалықты күшті әрекеттесетініне байланысты әртүрлі қашықтықтарды өтеді. Белгісіз затты анықтау үшін әр химиялық заттың нақты тежелу коэффициентінн (R_f) қолдануға болады.

Қағаз хроматографиясы

Қағаз хроматографиясы

Қағаз хроматографиясы - бұл хроматографиялық қағаздың жолағына үлгінің кішкене нүктесін не сызығын қою арқылы орындалатын әдіс. Қағаз еріткіштің аз мөлшері орналасқан контейнерге салынып, кақпақпен жабылады. Еріткіш қағаз бойымен көтерілгенде, үлгіні өзімен ала кетіп, оны қағаз бетіне жаяды. Қағаз целлюлозадан, полярлық заттан жасалған және қоспаның құрамындағы полярлы заттар целюлозамен әрекеттесіп, онымен байланысады, сондықтан тез тежеліп қалады. Ал полярлығы төмен заттар алдыға жылжи береді.

Жұқа қабатты хроматография (TLC)

Жұқа қабатты хроматография (TLC) - әртүрлі биохимиялық заттарды стационарлы және жылжымалы фазалар арасында тарату арқылы оларды бөлетін кеңінен қолданылатын зертханалық әдіс. Бұл қағаз хроматографиясына ұқсас. Алайда, бұл әдісте тегіс, инертті субстратқа жағылған кремнийлі гель, глинозем немесе целлюлоза сияқты адсорбенттің жұқа қабаты стационарлы фаза рөлін атқарады. TLC өте көп қолданыс тапты; бірнеше үлгіні бір қабатта бір уақытта бөліп алуға болады, дәрі-дәрмектердің деңгейі мен судың тазалығын сынақтан өткізу үшін де өте пайдалы. Айқас ластану ықтималдығы төмен, өйткені әр бөлу жаңа қабатта орындалады. Қағазбен салыстырғанда бұл әдіс жылдамырақ, жақсырақ бөледі, сандық талдауға келеді, әртүрлі адсорбенттерді таңдауға болады. Еріткішті аз қолданып, жақсы ажыратымдылықпенжылдам бөлу үшін өнімділігі жоғары TLC (HPTLC) қолдануға болады. Оған қоса, ертеректе хромосомаларды саралау үшін де TLC қолданылған, ол үшін олардың гельде жылжыған қашықтығын анықтайтын (бөлу бөлек саты болды).

Кеңейтілген төсенішпен жүретін адсорбцияылық хроматографиялық бөліну

Кеңейтілген төсенішпен жүретін хроматографилық адсорбция (EBA) бағаны көбіне биохимиялық бөлу процесстерінде қолданылады. Ол кеңейтілген төсеніштің төменгі жағындағы кеуекті бұғаттаушы тор астыдағы өзін-өзі тазарту функциясы бар қысымды теңестіруші сұйық таратушыдан, кеңейтілген төсеніштің жоғарғы бөлігіндегі кері шаю арқылы тазаланатын шүмек механизмінен тұрады.

Кеңейтілген төсенішпен жүретін адсорбцияылық хроматографиялық бөліну - тазартылмаған, лас үлгіден нәруыздарды тікелей бөліп алудың ыңғайлы және тиімді әдісі. EBA хроматографиясында алдымен нығыздалған төсеніш теңестіруші буфердің жоғары қарай ағынымен кеңейтіледі. Содан кейін еритін нәруыздардың, ластаушы заттардың, жасушалар мен жасуша қалдықтарының қоспасы кеңейтілген төсеніш арқылы жоғары қарай өтеді. Бізге қажет нәруыздар адсорбентке жабысады, ал ластаушылар ары қарай өтеді. Жоғары қарай ағынға элюция буферін жіберген кезде қажетті нәруыздар кеңейтілген төсеніштен десорбциялана бастайды, немесе, егер ағынды кері айдаса, бөлшектер тез төменге нығыздалады, кейін оларға адсорбцияланған нәруыздарды элюция буферінің көмегімен элюциялап алуға болады. Элюция үшін қолданылатын режим (кеңейтілген режим не нығыздалған режим) үлгінің сипаттамасына байланысты таңдалады. Элюциядан кейін адсорбент белгілі бір еріткішпен тазаланып, келесі қолдануға не сақтауға дайындалады.

Жылжымалы фазаның күйіне байланысты әдістердің жіктелуі

Газ хроматографиясы

Газ хроматографиясы (GC), кейде газ-сұйық хроматографиясы деп те атайды (GLC) - жылжымалы фаза газ болып табылатын бөлу әдісі. Газды хроматографиялық бөлу әрқашан бағанда жүзеге асырылады, олар әдетте «толтырылған» немесе «капиллярлы» деп жіктеледі. Толтырылған бағандар - бұл газды хроматографияның қарапайым түрі, олар арзан әрі пайдалану оңай және көбінесе жеткілікті өнімділік береді. Капиллярлы бағандар әдетте әлдеқайда жоғары ажыратымдылық береді және қымбатқа түседі, әсіресе күрделі қоспалар үшін кеңінен қолданылады. Бағандардың екі түрі де адсорбент емес әрі химиялық инертті материалдардан жасалған. Тот баспайтын болат пен әйнек толтырылған бағандар жасауға, ал квартц пен балқытылған кремнезем капиллрлы бағандар жасауға қолданылады.

Газ хроматографиясы қатты немесе тұтқыр сұйық стационарлы фаза (көбінесе сұйық, кремний негізіндегі материал) мен жылжымалы газ (көбінесе гелий) арасындағы аналиттің таралу тепе-теңдігіне негізделген. Стационарлы фаза кіші диаметрлі (әдетте диаметрі 0,53 - 0,18 мм) әйнектен немесе ерітілген кремнийден жасалған түтікке (капиллярлық бағанның) немесе үлкен металл түтіктің (толтырылған бағанның) ішіндегі қатты матрицаға жабыстырылады. Ол аналитикалық химияда кеңінен қолданылады; GC-да қолданылатын жоғары температура биохимияда жиі кездесетін жоғары молекулалық массалы биополимерлер мен нәруыздарды зерттеуге жарамсыз етеді (себебі, жоғары температура оларды денатурациялайды), ол мұнай өнімдерін зерттеуде, экологиялық мониторинг және экологияны қалпына келтіру, өнеркәсіптік химия салаларында қолдануға қолайлы. Ол зерттеуші химия салаларында да кең қолданылады.

Сұйық хроматография

Препаративті HPLC аппараты

Сұйық хроматография (LC) - жылжымалы фазасы сұйықтық болатын хроматографиялық бөлу әдісі. Оны бағанда да, жазықта да орындауға болады. Қазіргі кезде сұйық хроматография бағанды толтыруға өте кішкентай бөлшектерді пайдаланады және салыстырмалы түрде жоғары қысыммен жұмыс істейді, мұндай LC жүйелерін өнімділігі жоғары сұйық хроматография (HPLC) деп атайды.

HPLC-да үлгі үлкен қысымдағы жылжымалы фазаның әсерінен стационарлы фазамен (бөлшектер, кеуекті монолит, немесе кеуекті мембрана) толтырылған баған бойымен күштеп жылжиды. HPLC жылжымалы және стационарлы фазалардың полярлығына байланысты екі түрлі класқа бөлінген. Стационарлы фазаның жылжымалы фазадан гөрі полярлы болатын әдістері қалыпты фазалық сұйық хроматография (NPLC) және керісінше жылжымалы фаза көбірек полярлы болатын әдістері кері фазалық сұйық хроматография (RPLC) деп аталады. Мысалы, NPLC кезінде жылжымалы фаза ретінде толуол, стационар фаза ретінде - кремнезем қолданылуы мүмкін, ал RPLC - ға мысал су мен метанол қоспасы жылжымалы фаза фаза және C18 (октадецилсилил) стационарлы фаза болатын әдіс.

Төменде осы әдістің кейбір арнайы әдістері көрсетілген.

Суперкритикалық сұйықтық хроматографиясы

Суперкритикалық сұйықтықтық хроматографиясы - жылжымалы фазасы температура мен қысымның критикалық мәнінен асқан, не оған таяу сұйықтық болатын бөлу әдісі

Бөлу механизмі бойынша әдістердің жіктелуі

Адсорбциялық хроматография

Міндетті түрде қатты стационарлы фаза қолданылады, ал жылжымалы фаза сұйық та, газ да болуы мүмкін. Еріген заттар қатты бөлшектердің бетіне адсорбцияланады. Адсорбция қаншалықты күшті болса, еріген зат соншалықты баған арқылы баяу жүреді.

Таралу хроматографиясы

Көбінесе газ хроматографиясы үшін қолданылады. Онда балқытылған кремнеземге адсорбцияланған сұйық стационарлы фаза қолданылады. Еріген заттар жылжымалы фаза мен стационарлы фаза арасында әртүрлі таралу коэффициенттерімен тепе-теңдікке келіп, соның арқасында олар әртүрлі жылдамдықпен қозғалады.

Ион алмасу хроматографиясы

Ион алмасу хроматографиясы (әдетте иондық хроматография деп аталады) зардтарына байланысты аналиттерді бөлу үшін ион алмасу механизмін қолданады. Ол әдетте бағандарда орындалады, бірақ ол жазықта да қолданылуы мүмкін. Ион алмасу хроматографиясында зарядталған қосылыстарды, соның ішінде аниондар, катиондар, аминқышқылдар, пептидтер мен нәруыздарды бөлу үшін зарядталған стационарлы фаза қолданылады. Кәдімгі әдістерде стационарлы фаза - ион алмасу шайыры, ол зарядталған функционалды топтармен жүктелген, бұл топтар қосылыстың кері зарядталған топтарымен әрекеттеседі де, оларды тежейді. Ион алмасу хроматографиясының екі түрі бар: Катион Алмасу және Анион Алмасу. Катион Алмасу хроматографияда стационарлы фаза теріс зарядталған, ал алмастырылатын ион - катион, ал Анион Алмасу хроматографияда стационар фаза оң зарядталған, ал алмастырылатын ион - анион. Ион алмасу хроматографиясы Жылдам нәруызды сұйық хроматография (FPLC) көмегімен нәруыздарды тазарту үшін жиі қолданылады.

Жақындық хроматографиясы

Жақындық хроматографиясы аналит пен белгілі бір молекулалар арасындағы селективті коваленттік емес өзара әрекеттесуге негізделген. Бұл әдіс өте спецификалық, бірақ өзгерістерге тұрақты емес. Көбінесе биохимияда белгілермен байланысқан нәруыздарды тазартуда қолданылады. Бұл гибридті нәруыздар полигистидинді белгілер, биотин немесе антигендер сияқты қосылыстармен белгіленеді. Бұл белгілер стационарлы фазамен спецификті жолмын байланысады. Тазалағаннан кейін, әдетте, белгілердің көбісі алынып тасталады және таза нәруыз алынады.

Жақындық хроматографиясы биомолекуланың металға жақындығын жиі қолданады (Zn, Cu, Fe және т.б.). Бағандар көбінесе қолмен дайындалады. Дәстүрлі жақындық бағандары қажетсіз биомолекулалардан үлгіні тазарту үшін дайындық қадамы ретінде қолданылады.

Алайда, жақындық хроматографиясының қасиеттерін қолданатын HPLC әдістері бар. Иммобилизацияланған металлға жақындық хроматографиясы (IMAC) жоғарыда аталған молекулалардың металға салыстырмалы жақындығын қолданып бөлуге пайдалы. Қажет жақындықты жасау үшін көбінесе бұл бағандарды әртүрлі металдармен толтыруға болады.

Өлшем бойынша бөлу хроматографиясы

Өлшем бойынша бөлу хроматографиясы (SEC), немесе басқаша гельден өту хроматографиясы (GPC) немесе гельмен сүзу хроматографиясы молекулаларды өлшеміне қарай бөледі (немесе гидродинамикалық диаметріне немесе гидродинамикалық көлеміне сәйкес). Кіші молекулалар ортаның кеуектеріне ене алады, сондықтан олар тежеліп, жылжымалы фазаның ағынынан шығарылады. Аналит молекулаларының өлшеміне байланысты олар кеуектерде әртүрлі уақыт тежеледі. Алайда, орташа кеуек өлшемінен үлкен молекулалар кеуектерге ене алмайды, сондықтан олар айтарлықтай тежелмейді; мұндай компоненттер бірінші болып бағаннан элюцияланады. Бұл әдетте ажыратымдылығы төмен хроматография әдісі, сондықтан көбінесе тазартудың соңғы сатысы болып табылады. Бұл әдіс әсіресе тазартылған нәруыздардың үшіншілік және төртіншілік құрылымын анықтау үшін пайдалы, себебі оны бастапқы ерітінді жағдайында жүргізуге болады.

Арнайы әдістер

Кері фазалық хроматография

Кері фазалық сұйық хроматография (RPLC) - жылжымалы фаза стационарлы фазадан едәуір полярлы болатын кез-келген сұйық хроматография әдісі. Оның бұлай аталу себебі, қалыпты фазалы сұйық хроматографида жылжымалы фаза стационарлы фазаға қарағанда азырақ полярлы. RPLC-да жылжымалы фазадағы гидрофобты молекулалар гидрофобты стационарлы фазаға адсорбцияланады. Сндықтан да, жылжымалы фазадағы гидрофильді молекулалар алдыға жылжып, бірінші болып бағаннан элюцияланады. Бөлу бағандары әдетте кремний бөлшектерінің субстратымен байланысқан C8 немесе C18 көміртегі тізбегінен тұрады.

Гидрофобты әрекеттесу хроматографиясы

Нәруыздар мен хроматографиялық матрица арасындағы гидрофобты әрекеттесуді нәруыздарды тазарту үшін пайдалануға болады. Гидрофобты әрекеттесу хроматографиясында матрица материалы гидрофобты топтармен алмастырылған. Бұл топтарға метил, этил, пропил, октил немесе фенил топтары кіреді. Тұздың жоғары концентрациясы болғанда, нәруыздардың бетіндегі полярлы емес бүйір тізбектер гидрофобты топтармен әрекеттеседі; гидрофобты эффект ерітіндінің иондық күшінің жоғарылауымен артады. Осылайша, үлгі бағанға полярлығы өте жоғары буферде түседі. Элюант әдетте тұз концентрациясы төмендетілген, жуғыш заттар концентрациясы жоғарлаған (олар гидрофобты әрекеттесуді бұзады) немесе рН өзгертілген судағы буфер болып табылады.

Жалпы, гидрофобты әрекеттесу хроматографиясы (HIC) үлгі рН өзгеруіне немесе өте күшті еріткіштерге сезімтал, ал жоғары тұз концентрациларына шыдамды болса тиімді болып табылады. Әдетте, талдау кезінде буфердегі тұздың мөлшерін өзгертіп отырады. 2012 жылы Мүллер мен Францреб ірі қара сарысуының альбуминін (BSA) қолдана отырып, төрт түрлі гидрофобты шайырдағы HIC-ға температураның әсерін сипаттады. Зерттеу температураны өзгертіп, BSA-ның матрицамен байланыс жақындығына әсерін зерттеді. Цикл температурасының 10-50 C болуы BSA-ны матрицадан шайып шығуға жеткіліксіз екенін, дегенмен баған аз ғана рет қолданылса өте тиімді екені анықталды. Температураны өзгерту арқылы әсер ету мүмкіндігі зертханаларға тұзды сатып алу шығындарын азайтуға және ақшаны үнемдеуге мүмкіндік береді.

Егер тұздың жоғары концентрациясы мен температураның өзгерісін болдырмау қажет болса, өте гидрофобты бәсекелес затты қолдануға болады. HIC-дің тұзға тәуелсіз әдісі деген атпен белгілі бұл әдіс Адамның G иммуноглобулинін (IgG) тікелей қан сарысуынан жеткілікті шығыммен бөлуге мүмкіндік берді. IgG-ды матрицадан ығыстыру үшін бәсекелес ретінде бета-циклодекстринді пайдаланды. Бұл тұзға сезімтал үлгілерді HIC арқылы бөлуге мүмкіндік ашады, өйткені тұздың жоғары концентрациялары нәруыздарды тұндырады.

Гданьск Технология Университетінің химия факультетінде орналасқан Екі өлшемді GC\GC\TOFMS хроматографы. Гданьск, Польша, 2016

Екі өлшемді хроматография

Кей жағдайларда бір бағанды пайдалану күрделі үлгілердегі аналиттерді анықтау үшін жеткілікті селективтілік бере алмайды. Екі өлшемді хроматография біріншісінен физика-химиялық қасиеттері ерекшеленетін екінші бағанды пайдалану арқылы керек шыңдардың ажыратымдылығын арттырады. Екінші бағандағы қатты тіректе тежелу механизмі бірінші бағаннан өзгеше болғандықтан, бір өлшемді хроматографиямен ажыратылмайтын қоосылыстарды екі өлшемді хроматография арқылы бөліп алуға болады. Сонымен қатар, екінші өлшемдегі бөлу бірінші өлшемге қарағанда тезірек жүреді.

Екі өлшемді TLC бөлудің мысалы - төртбұрышты тақтайшаның бір бұрышынан үлгіні бір еріткішпен бөліп, кейін ауамен кептіріп, содан кейін тақтайшаны 90° айналдырып, екінші еріткіште қайта бөлу.

Екі өлшемді хроматографияны GC немесе LC арқылы бөлуге де қолдануға болады. Бұл бөлу әдісін орта бөлігін кесіп алу тәсілі арқылы қолдануға болады, ол үшін бірінші өлшемнің бойынан белгілі бір аймақтар екінші өлшем бойынша бөлу үшін таңдалады да, тек солар ған екінші рет бөлінеді. Екі өлшемді хроматографияда керісінше барлық аналиттерді екінші өлшемге жіберуге де болады.

Симуляцияланған қозғалмалы төсеніш хроматографиясы

Симуляцияланған қозғалмалы төсеніш (SMBC) әдісі - өнімділігі жоғары сұйық хроматографиясының бір түрі; бұл әдіс басқа жолмен бөлінуі қиын немесе бөлінуі мүмкін емес бөлшектер мен химиялық қосылыстарды бөлуге қолданылады. Бұл жоғары өнімді бөліну клапан-бағандық қондырғы арқылы жүзеге асырылады. Бұл қондырғы арқылы стационарлы фазаны шектеусіз ұзартуға болады. Препаративті хроматографияда қолданылатын қозғалмалы төсеніш әдісінде енгізу және аналиттердің шығарылуы бір уақытта және үздіксіз болады, бірақ үздіксіз қозғалатын төсенішпен туған қиындықтарға байланысты, симулцияланған қозғалмалы төсеніш әдісі ұсынылды. Төсенішті жылжытудың орнына симуляцияланған қозғалмалы төсеніш әдісінде үлгіні енгізу және аналиттердің шығу позициялары үнемі өзгеріп отырады, бұл төсеніш жылжып жатқандай әсер береді. Шынайы қозғалмалы төсеніш хроматографиясы тек теориялық түсінік болып табылады. SMBC тек оның симуляциясы. Бұған бір-біріне жалғанған бірнеше бағандарды және үлгіні мен еріткішті беретін, сонымен қатар кез-келген бағанның тиісті орындарынан аналит пен қалдықтарды шығаруды қамтамасыз ететін, онымен қоса, бірдей уақыт аралықтарында үлгі мен еріткішті қарама-қарсы бағытта беріп, аналит пен қалдықтарды шығару позицияларын сол уақытта өзгерте алатын күрделі клапан қондырғыларын қолдану арқылы қол жеткізілді.

Пиролизді газ хроматографиясы

Пиролиз-газ хроматографиясы-масс спектрометрия (Пиролиз/GC/MS) - үлгіні кіші молекулаларға қыздыру арқылы ыдыратып, газ хроматографиясымен өнімдерді бөліп, масс спектрометриясын қолдана отырып оларды анықтайтын химиялық талдау әдісі.

Пиролиз - бұл инертті атмосферада немесе вакуумда материалдардың термиялық ыдырауы. Үлгіні платина сымымен тікелей байланыстырып немесе кварц түтікке үлгіні салып, 600-1000 °C дейін тез қыздырады. Мақсатына байланысты одан да жоғары температура қолданылуы мүмкін. Пиролизде қыздырудың үш түрлі әдісі қолданылады: изотермиялық пеш, индуктивті қыздыру (Кюри Пойнт филаменті) және платина филаменттерін қолданып резистивті қыздыру. Ірі молекулалар өздерінің ең әлсіз нүктелерінде үзіліп, кішірек, ұшқыш бөлшектер түзеді. Бұл фрагменттерді газ хроматографиясымен бөлуге болады. Пиролиз/GC/MS хроматограммалары әдетте күрделі, өйткені ыдырау өнімдерінің көптеген түрлері қалыптасады. Деректер материалды дайын ақпаратпен сәйкестендіру үшін немесе GC/MS деректері арқылы жеке бөліктерді зерделеп, құрылымдық ақпарат алу үшін қолданылуы мүмкін. Полярлы бөлшектердің ұшқыштығын жоғарылату үшін әртүрлі метилдеуші реагенттерді пиролиз алдында үлгіге қосуға болады.

Арнайы пиролизерлерден басқа, қатты және сұйық үлгілердің пиролизін тікелей қыздыруды қамтамасыз ететін Бағадарламаланатын Температуралы Буландырғыш (PTV) инжекторларының ішінде жасауға болады, олар үлгіні тез (30°C/с-қа дейін) 600–650°C дейін қыздыра алады. Бұл кейбір пиролиз процесстері үшін жеткілікті. PTV-дің негізгі артықшылығы - арнайы құралды сатып алудың қажеті жоқ және пиролизді күнделікті GC талдауындай жасауға болады. PTV үшін қарапайым GC-дың кварцты инлет лайнерлерін пайдалануға болады. Бұл әдіс арқылы сандық мәліметтерді алуға болады, сонымен қатар PTV инжекторының ішінде деривизация да жасауға болатындығы жариялануда.

Жылдам нәруызды сұйық хроматография

Жылдам нәруызды сұйық хроматография (FPLC) - бұл нәруыз қоспаларын талдау немесе тазарту үшін жиі қолданылатын сұйық хроматографияның бір түрі. Хроматографияның басқа түрлеріндегіндей, бөліну қоспаның әр түрлі компоненттерінің екі материалға, қозғалатын сұйықтыққа («жылжымалы фаза») және кеуекті қатты затқа (стационарлы фаза) жақындығы әртүрлі болуына негізделген. FPLC-да жылжымалы фаза судағы ерітінді немесе «буфер» болып табылады. Буфер ағымының жылдамдығы сорғымен басқарылады және қалыпты түрде сақталады, ал буфердің құрамы екі немесе одан да көп сыртқы резервуарлардан әртүрлі қатынаста сұйықтықтарды тартып, араластыру арқылы өзгеруі мүмкін. Стационарлы фаза - бұл цилиндрлік шыныға немесе пластикалық бағанға толтырылған көбінесе өзара байланысқан агароздан жасалған бөлшектерден тұратын шайыр. Қазіргі кезде FPLC шайырларының бөлшектерінің өлшемдеріне, беттік лигандтардың түріне байланысты көптеген түрі қолжетімді.

Қері ағымды хроматография

HPCCC жүйесінің мысалы

Кері ағымды хроматографи (CCC) - сұйық-сұйық хроматографияның бір түрі, мұнда стационарлы да, жылжымалы фаза да сұйықтық болып табылады.CCC құралы бобинге оралған ашық түтіктен тұратын бағанды қажет етеді. Бобин екі осьті (кардиоид бойымен) айналмалы қозғалыста, бұл әр айналу кезінде бағанға әсер ететін ауыспалы ауырлық күш өрісін тудырады. Бұл қозғалыстың әсерінен бағанда бір айналым кезінде бір таралу қадамы жүреді, және пайдаланылатын екі сұйық фазаның арасындағы таралу коэффициентіне байланысты компоненттер бөлінеді. Бүгінгі таңда CCC-дың көптеген түрлері бар. Оларға HSCCC (Жылдамдығы жоғары кері ағымды хроматография) және HPCCC (Өнімділігі жоғары кері ағымды хроматография) жатады. HPCCC - қазіргі уақытта қол жетімді аспаптардың ең соңғы және ең жақсы нұсқасы.

Периодты кері ағымды хроматография

Кері ағымдық хроматографиясынан айырмашылығы, периодты кері ағымды хроматография (PCCC) қатты стационарлы фазаны және сұйық жылжымалы фазаны қолданады. Осылайша, ол кәдімгі CCC-ге қарағанда кәдімгі жақындық хроматографиясына ұқсас. PCCC бір-біріне қосылған бірнеше бағандарды пайдаланады. Бұл режим осы қатардағы бірінші бағанды шайыр толық қаныққанға дейін бағаннан өтіп кететін өнімді жоғалтпай артық жүктеуге мүмкіндік береді. Өтіп үлгерген өнім келесі бағандарда тежеледі. Келесі қадамда бағандар бір-бірінен ажыратылады. Бірінші баған шайылып, элюцияланады, ал келесі бағандар жүктеледі. Бірінші баған қайта тепе-теңдікке келген кезде, ол жүктеме ағынына соңғы баған ретінде қайта енгізіледі. Содан кейін процесс циклді түрде жалғасады.

Хиралды хроматография

Хиралды хроматография стереоизомерлердің бөлінуін қамтиды. Энантиомерлер жағдайында бір-бірінің үш өлшемді айна кескіндері болуынан басқа бұл молекулалардың химиялық немесе физикалық айырмашылықтары жоқ. Кәдімгі хроматография немесе бөлудің басқа процестері оларды бөлуге қабілетсіз. Хиралды бөліну үшін мобильді фаза не стационарлы фаза хиралды болуы қажет, бұл аналитттер мен жылжымалы не стационарлы фазалар арасында әртүрлі жақындық тудырады. Қазіргі кезде, NPLC-ға да, RPLC-ға да HPLC хиралды бағандары (хиралды стационарлы фазамен) қол жетімді.

Сулы қалыпты фазалық хроматография

Сулы қалыпты фазалық хроматография (ANPC) кәдімгі қалыпты фазалық элюциямен сипатталады (яғни жылжымалы фаза стационарлы фазадан едәуір аз полярлы), бірақ ерекшелігі, мұнда су жылжымалы фазалық еріткіш жүйесінің құрамдас бөлігі болып табылады. Ол гидрофильді әрекеттесу сұйықтық хроматографиясынан (HILIC) ерекшеленеді, себебі тежелу механизмі таралуға емес, адсорбцияға негізделген.

Хроматографияны сипаттайтын шамалар

Негізгі шамалар

• Баған өлшемдері: ұзындығы, радиусы $L,r$
• Ағынның көлемдік жылдамдығы - бір бірлік уақытта баған бойымен жылжитын еріткіш көлемі $u_{V}$
• Ағынның сызықтық жылдамдығы - еріткіштің бір бірлік уақытта жылжитын қашықтығы $u_{x}$
• Тежелу уақыты - қоспаны енгізу мен компоненттің детекторға жетуі аралығында өткен уақыт $t_{R}$
• Тежелу көлемі - компонентті элюциялауға жұмсалған еріткіш көлемі

$V_{R}=u_{V}t_{R}$

• Өлі уақыт - еріткіштің өзінің баған бойын өтуге жұмсаған уақыты

$t_{0}={\frac {L}{u_{x}}}$

• Тежелу коэффициенті - компонентті элюциялауға өлі уақыттан қанша есе көп уақыт кеткенін көрсететін шама

$k={\frac {t_{R}-t_{0}}{t_{0}}}$

• Салыстырмалы тежелу (кейде, бөліну коэффициенті) - екі компоненттің қаншалықты бөлінгенін көрсететін шама. Салыстырмалы тежелу ағын жылдамдығына тәуелсіз, сондықтан ағын жылдамдығы өзгеретін эксперименттерде компоненттерді анықтау үшін қолданыла алады.

$\alpha ={\frac {k_{1}}{k_{2}}}=$ мұндағы $k_{1}>k_{2}$

Ажыратымдылық және өнімділік

Еріген зат баған бойымен қозғалған кезде ол гаусс қисығына ұқсас болып жайыла бастайды, оның тежелу уақыты ұзарған сайын, қисықтың ені өсе береді. Жалпы алғанда бұл қисықты келесі теңдеумен сипаттауға болады:

$C={\frac {m}{\sqrt {4\pi Dt}}}\exp({\frac {-x^{2}}{4Dt}})$

Мұндағы $C$ - концентрация, $t$ - уақыт, $D$ - Фик заңдарындағы диффузия коэффициенті, $x$ - баған басының шыңнан қашықтығы, $m$ - белгілі бір константа.

Көріп тұрғанымыздай, бұл гаусс қисығының орташа квадраттық ауытқуы:

$\sigma ={\sqrt {2Dt}}$

Гаусс қисығының теңдеуінен қорытсақ, шыңның түбіндегі ені $w=4\sigma$ ал шыңның жарты биіктігіндегі ені $w_{1/2}=2.36\sigma$ екені анықталады.

Хроматографияда, екі шыңның бір-бірінен ажыратылымдылығы компоненттердің тежелу уақыттарының айырымының шыңдардың орташа еніне қатынасы ретінде анықталады:

$R={\frac {\Delta t_{R}}{\bar {w}}}={\frac {2(t'_{R}-t''_{R})}{w'+w''}}$

мұндағы $t'_{R}$ және $t''_{R}$ сәйкесінше бірінші және екінші компоненттің тежелу уақыттары, $w',w''$ сол компоненттерге сәйкес шыңдардың түбіндегі ені.

Егер шыңды Гаусс қисығы ретінде қарастырсақ, онда

$R={\frac {1.177(t'_{R}-t''_{R})}{w'_{1/2}+w''_{1/2}}}$

мұндағы $t'_{R}$ және $t''_{R}$ сәйкесінше бірінші және екінші компоненттің тежелу уақыттары, $w'_{1/2},w''_{1/2}$ сол компоненттерге сәйкес шыңдардың жарты биіктігіндегі ені.

Өнімділікті сипаттайтын негізгі шама - баған бойындағы теориялық табақтардың саны. Бір табақтың биіктігі деп еріген зат бір $H$-қа жылжығанда, гаусс қисығының дисперсиясы $H^{2}$-қа артатын ұзындықты айтамыз. Демек, $H$ мәні кішірейген сайын, еріген заттың жайылуы баяулайды, хроматограммадағы шыңның ені сығылады. Бұл ұзындықты анықтау үшін келесі қорытуды қолданайық:

$\sigma ^{2}=2Dt=2D{\frac {x}{u_{x}}}={\frac {2D}{u_{x}}}x=Hx$

$\sigma ^{2}=Hx$

Теориялық табақтардың саны - баған бойына қанша табақ сиятындығы, оны анықтау үшін:

$N={\frac {L}{H}}={\frac {16L^{2}}{w_{L}^{2}}}$

мұндағы $N$ - теориялық табақтар саны - хроматографияның өнімділігі, $w_{L}$ - компоненттің жайылған ұзындығы.

Бұл түрде теңдеуді қолданған ыңғайсыз. Байқайтын болсақ, бұл шама өлшем бірліксіз, сондықтан біз ондағы мәндерді хроматограммадағы мәндермен алмастыра аламыз:

$N={\frac {16t_{R}}{w^{2}}}={\frac {5.55t_{R}^{2}}{w_{1/2}^{2}}}$

мұндағы $w$ - хроматограммадағы уақытпен өлшенген шыңның ені, $w_{1/2}$ - хроматограммадағы шыңның жарты биіктігіндегі уақытпен өлшенген ені.

Өнімділігі жоғары сұйық хроматографиядағы теориялық табақтың биіктігінің ағын жылдамдығына тәуелділігі Ван Деемтер теңдеуімен сипатталады. Бұл теңдеу аксиалды диффузияны, бойлық диффузияны және жылжымалы фаза мен стационарлы фаза арасындағы масса ауысымдарының кинетикасын ескеретін үшмүше болып табылады:

$H=A+{\frac {B}{u_{x}}}+Cu_{x}$

мұндағы $H$ - табақ биіктігі, $A$ - адсорбенттің толтыруының идеал емес болуынан туатын аксиалды диффузияны ескеретін мүше, $B$- дисперсияны тудыратын бойлық диффузияны ескеретін мүше, $u_{x}$ - ағынның сызықтық жылдамдығы $C$ - тепе-теңдік күйге баяу жетудің әсерінен туатын жайылуды ескеретін мүше.

Ашық түтікті бағандарда аксиалды диффузия мөлшері өте аз, себебі онда бағанды толтырып тұрған адсорбент жоқ. Сондықтан да ашық түтікті бағандар үшін $A=0$ деп алынады.

Бір біріне жақын орналасқан екі шыңның ажыратымдылығын Пурнелл теңдеуінің көмегімен де есептеуге болады:

$R={\frac {\sqrt {N}}{4}}{\frac {\alpha -1}{\alpha }}{\frac {k_{1}}{k_{1}+1}}$

мұндағы $N$ - көбірек тежелген шың (тежелу уақыты көбірек) бойынша өнімділік, $\alpha$ - осы екі шыңның салыстырмалы тежелуі, $k_{2}$ - көбірек тежелген шыңның тежелу коэффициенті.

Сондай-ақ

• Жақындық хроматографиясы
• Сулы қалыпты фазалық хроматография
• Байланысу селективтілігі
• Қанды зерттеудегі хроматография
• Хроматографияға арналған компьютерлік қосымшалар
• Көпбағанды кері ағынды еріткішпен градиентті тазарту (MCSGP)
• Әлсіз жақындық хроматографиясы